بافر آنزیم

۵٫۱ میکرو لیتر

آنزیم AluI

سه واحد

فرآورده PCR

۱۰ میکرولیتر

تهیه ژل ۵/۲ درصد آگارز مشابه ژل یک درصد است، با این تفاوت که در این حالت، ۵/۲ گرم آگارز در ۱۰۰ میلی­لیتر بافر TAE 1x ،حل می­ شود. بعد از انجام واکنش­های هضم، برای بررسی اندازه­ قطعات حاصل از هضم آنزیمی، کل حجم هر نمونه با ۲ میکرولیتر بافر بارگذاری، آمیخته و به چاهک ژل ۵/۲ درصد انتقال داده شد. سپس، ولتاژ دستگاه در ۷۵ ولت تنظیم و به مدت ۹۰ دقیقه فرایند الکتروفورز انجام شد. پس از پایان زمان الکتروفورز، ژل روی صفحه U.V. Transilluminator بررسی و از آن عکس­برداری شد. به کمک خط­کش­های DNA که همراه نمونه­ها در ژل بارگذاری شده بود، قطعات حاصل از برش، اندازه ­گیری شد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۶- واکاوی همراهی چندریختی­ها با صفات تولیدی و تولید­مثلی
در این پژوهش همراهی چندریختی­های ژن هورمون رشد و گیرنده­ی آن با صفات تولید شیر، سخت­زایی، دوقلوزایی، مرده­زایی، فاصله­ی زایش، شمار روز­های باز، فاصله­ی بین زایش تا اولین فحلی و شمار تلقیح به ازای هر آبستنی بررسی شد. مدل آماری استفاده شده، به صورت زیر بود.
y_ijklm = µ + hys_i +p_j+ g_k +sire_l +b₁(FCA_ijklm) + e_ijklm
y_ijklm= عملکرد تولیدی یا تولید مثلی حیوان m­ام، با ژنوتیپ k، در دسته­ی l­امین گاو نر، j­امین شکم زایش، i­امین دسته­ی گله- سال- فصل زایش
µ= میانگین کل
hys_i= اثر ثابت i­امین گله – سال- فصل زایش
p_j= اثر ثابت j­امین شکم زایش
g_k= اثر ثابت k­امین ژنوتیپ
sire_l= اثر تصادفی l­امین گاو نر
b₁= ضریب رگرسیون متغیر­های وابسته (صفات) از سن در هنگام اولین زایش
FCA_ijklm= سن در هنگام اولین زایش در گاو m­ام، با ژنوتیپ k­ام، در دسته­ی l امین گاو نر، j امین شکم زایش، i­امین گله – سال – فصل زایش
e_ijklm= اثر تصادفی باقی­مانده با میانگین صفر و توزیع نرمال
واکاوی چندریختی­ها با صفات تولیدی و تولید مثلی با بهره گرفتن از نرم­افزارSAS انجام شد. آنالیز همراهی صفات پیوسته با رویه­ی MIXEDو صفات گسسته با رویه­ی GENMOD انجام شد. میانگین حداقل مربعات ژنوتیپ­ها در صفات پیوسته، در سطح ۵ درصد با هم مقایسه شدند. در واکاوی صفات گسسته، ژنوتیپ­های هر ژن با روش رگرسیون لجستیک مقایسه شدند و در آن از معیار نسبت بخت^[۲۸] استفاده شد.
داده ­ها­ی تولید شیر از مرکز اصلاح نژاد دام کشور گرفته شدند و داده ­های صفات تولید­مثلی از مدیریت گاوداری­های مورد مطالعه، دریافت شدند. شمار داده ­ها برای هر یک از صفات تولید شیر، فاصله­ی زایش، سخت­زایی، تعداد تلقیح به ازا­ی هر آبستنی، مرده­زایی، دوقلوزایی، نخستین فحلی پس از زایش و رزوهای باز، ۴۵۲ داده بود. در واکاوی صفات پیوسته، افزون بر مقایسه­ میانگین ژنوتیپ­های هر ژن، اثر جایگزینی الل­ها نیز بررسی شد.
فصل چهارم
یافته­ ها
۴-۱- DNA ژنومیک
کیفیت و کمیت DNA ژنومیک بوسیله الکتروفورز با ژل آگارز یک درصد و دستگاه نانودراپNanodrop)) مدل T100 بررسی شد. غلظت DNA استخراج شده، ۵۰-۳۰ نانو­گرم DNA در هر میکرولیتر بود. نتایج الکتروفورز برخی از نمونه­های DNA استخراج شده در نگاره­ی ۴-۱ نشان داده شده است.
نگاره ۴-۱-الکتروفورز چند نمونه از DNA ژنومیک استخراج شده
۴-۲- فرآورده ­های واکنش­های PCR ژن­های هورمون رشد و گیرنده­ی آن
برای ازدیاد قطعه­ی ۴۲۸ جفت بازی از ژن هورمون رشد از آغازگر­های ارائه شده توسط (Lucy, 1993b) و برای ازدیاد قطعه­ی ۳۴۲ جفت بازی از ژن گیرنده­ی هورمون رشد از آغازگر­های ارائه شده توسط (Di Stasio et al., 2005) استفاده شد. نتیجه الکتروفورز محصولات PCR در نگاره­ی ۴-۲ ارائه شده است.
نگاره­ی ۴-۲- فرآورده ­های PCR در ازدیاد ژن هورمون رشد و گیرنده­ی آن
۴-۳- هضم محصولات PCR با آنزیم­ های برشی
۴-۳-۱ هضم محصولات PCR جایگاه ۵ ژن هورمون رشد با آنزیم برشی AluI
پس از ازدیاد قطعه­ی ۴۲۸ جفت بازی ژن هورمن رشد، فرآورده ­های PCR با آنزیم AluI هضم شدند. پس از الکتروفورز نتایج هضم با آنزیم AluI، و عکس­برداری از آن بوسیله اشعه UV، دو ژنوتیپ (LL,LV) دیده شد (نگاره۴-۳). با توجه به ناحیه­ی برشی آنزیم AluI، آلل V دارای قطعه­های ۲۶۵ ، ۱۴۷ ،۱۶ جفت بازی و آلل L دارای قطعه­های ۱۶ ،۵۱ ،۹۶ ،۲۶۵ جفت بازی هستند. بنابر­این، گاو­های هتروزیگوت LV دارای قطعه­های ۵۱ ،۹۶ ،۱۴۷ ،۲۶۵ جفت بازی و گاو­های هموزیگوت LL دارای قطعه­های ۵۱ ،۹۶ ،۲۶۵ جفت بازی بودند. قطعه­ی ۱۶ جفت بازی در ژل آگاروز قابل دیدن نبود.
نگاره­ی۴-۳- ژنوتیپ­های جایگاه ۵ ژن هورمون رشد
۴-۳-۲- فراوانی­های اللی و ژنوتیپی در جایگاه ۵ ژن هورمون رشد
فراوانی­های اللی در جایگاه ۵ ژن هورمون رشد برای آلل­های L و V به ترتیب برابر با ۶۹ و ۳۱ درصد و همچنین فراوانی ژنوتیپی برای ژنوتیپ­های LL و LV به ترتیب برابر با ۶۱ و ۳۹ درصد بود (جدول ۴-۱)
جدول ۴-۱- فراوانی اللی و ژنوتیپی ژن هورمون رشد

فراوانی ژنوتیپی(درصد)

فراوانی اللی(درصد)

شمار ژنوتیپ