بررسی بردباری به خشکی گیاه سویا نیز نشان داد که استرس کم­آبی میزان پایداری غشای سیتوپلاسمی را کاهش می­دهد (ژانگ و همکاران، ۲۰۰۷). کوچوا و جورجیوف (۲۰۰۳) نیز در ارزیابی مقاومت به خشکی ارقام Hordeum vulgare L. ، تخریب کمتری در غشاهای سلولی ارقام مقاوم تر به خشکی مشاهده کردند.
۲-۲-۴- فتوسنتز و هدایت روزنه­ای
تحقیقی که روی گیاه زیتون تحت تاثیر تنش آبی صورت گرفت، نشان داد مقدار آب کمی که در بافت­ها ذخیره می­ شود به سمت ریشه و برگ شیب پیدا می­ کند و در نتیجه رشد متوقف شده و فتوسنتز و تعرق غیر فعال می­شوند (سوفو، ۲۰۰۷).
در مطالعه­ ای که توسط (توماس^[۱۲۳]، ۲۰۰۰) بر روی Q. robur انجام گرفت، بیشترین تاثیر خشکی بر روی هدایت روزنه­ای بوده به­ طوری که تنش خشکی با کاهش هدایت روزنه­ای، تعرق را به صورت خطی کاهش داد، در حالی­که کاهش فتوسنتز کمتر بود. دایت مارووا^[۱۲۴] و همکاران (۲۰۰۹) پاسخ­های فیزیولوژیکی نهال­های Picea abiesرا تحت تنش خشکی مورد مطالعه قرار دادند و پتانسیل آبی برگ، هدایت روزنه­ای و تبادلات دی­اکسیدکربن را بررسی کردند. نتایج این بررسی نشان داد که تنش خشکی منجر به کاهش پتانسیل آب برگ شد و این کاهش در پتانسیل آبی توام با تغییرات سریع در هدایت روزنه­ای بود و با افزایش تنش خشکی هدایت روزنه­ای و تبادلات دی اکسیدکربن کاهش یافت و این تغییرات باعث افزایش توانایی گیاه برای زنده ماندن و رشد در طول دوره­ خشکی شدند. مدیاولا و اسکودرو^[۱۲۵] (۲۰۰۴) پاسخ­های روزنه­ای را نسبت به تنش خشکی در گونه­ های Q. rotundifolia وQ. faginea مورد مطالعه قرار داد. نتایج نشان داد که گونه­ Q. rotundifolia نسبت به گونه­ faginea Q. مقاوم­تر بود زیرا هدایت روزنه­ای آن طی تنش خشکی کمتر تغییر کرد. استیسی و آلن^[۱۲۶] (۱۹۹۷) گونه­ Q. havard را به مدت یک ماه در معرض تنش خشکی قرار دادند و با میزان تغییر جزئی که در میزان فتوسنتز و هدایت روزنه­ای رخ داد این گونه را یک گونه­ بردبار به خشکی اعلام کردند. تزارا و همکاران در سال ۲۰۰۳ با مطالعه بر روی گونه­ Lycium nodosum تحت تنش خشکی کاهش معنی­داری را در نرخ فتوسنتز و هدایت روزنه­ای در شرایط افزایش تنش مشاهده نمودند. در بررسی که روی میزان فتوسنتز و هدایت روزنه ای در دو گونه Q. ilexو Laurus nobilis تحت شرایط خشکی توسط آرنا^[۱۲۷] و همکاران (۲۰۰۸) انجام شد، نتیجه گیری کردند که تحت شرایط خشکی مساوی، میزان فتوسنتز و هدایت روزنه­ای در گونه Q. ilex نسبت به گونه L. nobilis بیشتر بود و در نتیجه به خشکی مقاوم­تر است.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

در تحقیقی که سالوادور و همکاران (۲۰۰۴) انجام دادند دریافتند که خشکی سبب کاهش پتانسیل اشباع اسمزی، هدایت روزنه­ای، تبخیر و تعرق و ظرفیت رشد ریشه می­ شود. مطالعه رائو (۲۰۰۸) روی ۵ گونه مهم منطقه تارایی از جمله Albizzia lebbek، Dalbergia sissoo، Laucaena laucocephala، Shorea robusta، Tectonia grandis نشان داد که تنش شدید خشکی موجب کاهش وزن خشک، فتوسنتز و تعرق در همه گونه‌ها و افزایش مقاومت روزنه­ای در تمامی این ۵ گونه گردیده است.
ژانگ (۲۰۰۴) با بررسی اکوتیپ­های مختلف صنوبر دارای خاک­هایی با میزان آب متفاوت به این نتیجه رسیدند که تغییر در مقدار آب، فتوسنتز و هدایت روزنه­ای را کاهش می­دهد و در اکوتیپ­های مختلف مقدار این کاهش متفاوت است. اپرون و دریر (۱۹۹۳) با مطالعه بر روی یک توده طبیعی از Q. petrea وQ. robur نتیجه گرفتند که بعد از انجام تنش خشکی در این گونه­ ها میزان فتوسنتزشان کاهش پیدا نکرد، بنابراین مشخص گردید که این گونه­ ها به خشکی مقاوم می­باشند. با بررسی ترزا و همکاران (۲۰۰۸) روی نهال­های Q. ilex طی استرس­های خشکی در میزان کلروفیل فلورسنس، فتوسنتز و کارایی مصرف آب در تیمارهای مختلف خشکی تفاوت معنی­داری مشاهده شد.
واگنر و دریر^[۱۲۸] (۱۹۹۷) با بررسی اثر تنش خشکی بر روی نهال­های سه گونه بلوط Q. petrea وQ. robur و Q. rubra مشاهده نمودند که در گونه Q. petrea میزان فتوسنتز و هدایت روزنه­ای، میزان بیوماس و عملکرد فتوسیستمII نسبت به دو گونه دیگر کمتر تغییر نمود و بنابراین به عنوان یک گونه مقاوم­تر شناسایی شد. در مطالعه­ ای که توسط بهبودیان^[۱۲۹] و همکاران (۱۹۸۶) بر روی تاثیر تنش کمبود آب بر میزان فتوسنتز در پسته خوراکی صورت گرفت، مشاهده نمودند که این گونه در شرایط سخت کم آبی در حالتی که پتانسیل آبی برگ به ۵- مگاپاسکال رسیده بود، قادر به انجام فتوسنتز می­باشد.
۲-۳- جذب عناصر
در مطالعه­ ای که توسط نیکان و قربانلی (۲۰۰۷) بر روی سویا صورت گرفت بیان کردند که تنش خشکی موجب افزایش پتاسیم در اندام هوایی شد. هم چنین در مطالعه­ ای که توسط لی^[۱۳۰] و همکاران (۲۰۰۳) بر روی برنج صورت گرفت بیان کردند که گونه­ های بردبار به خشکسالی سدیم بیشتری را دفع و با جذب بیشتر پتاسیم، نسبت سدیم به پتاسیم را در اندام هوایی خود پایین نگه می­دارند. در مطالعه­ ای که توسط منصوری و همکاران (۱۳۹۰) بر روی ژنوتیپ­های مختلف برنج ایرانی تحت تنش خشکی صورت گرفته بود بیان کردند که ارقام متحمل، سدیم بیشتری را دفع کرده و با جذب پتاسیم بیشتر، نسبت سدیم به پتاسیم را در اندام هوایی خود پایین نگه می دارند آن­ها گزارش کردند که تنها مقدار سدیم و پتاسیم در تفکیک ارقام متحمل از حساس نمی تواند معیار کافی باشد، بلکه نسبت این دو یون سدیم به پتاسیم عامل مهمتری است تنش خشکی عموما باعث بالا رفتن میزان یون سدیم و کاهش جذب یون پتاسیم می­ شود، چرا که سدیم تمامیت غشاء سلول­های ریشه را از بین برده و از جذب انتخابی سلول می­کاهد (ایزو و همکاران^[۱۳۱]، ۱۹۹۱). والیا و همکاران، (۲۰۰۵) با مطالعه­ ای که بر روی برنج انجام داده بودند به این نتیجه رسیدند که تجمع سدیم در گیاه منجر به خسارت می­ شود. در مطالعه­ ای که توسط تاج­عبدی­پور (۲۰۰۴) بر روی سه رقم پسته بادامی نشان داد که دوره آبیاری تاثیر معنی­داری بر غلظت پتاسیم برگ ندارد در حالی که غلظت پتاسیم ساقه و ریشه به طور معنی داری تحت تاثیر افزایش دور آبیاری قرار می­گیرد. در مطالعه­ ای که توسط آخوندی^[۱۳۲] و همکاران، (۲۰۰۶) بر روی یونجه انجام شد به این نتیجه رسیدند که سدیم و پتاسیم در اثر تنش خشکی در اندا­م­های گیاه افزایش می­یابد. هم­چنین نشان دادند که نسبت سدیم به پتاسیم در اندام­های هوایی و ریشه، با افزایش تنش خشکی افزایش می­یابد. هم­چنین در مطالعاتی که توسط حاج میرزایی^[۱۳۳]، (۲۰۰۶) بر روی بنه و ترنر، (۱۹۸۵) بر روی فلفل و بابو و پرکاش^[۱۳۴]، (۲۰۰۶) بر روی انگور انجام شد بیان کردند غلظت فسفر ریشه با افزایش تنش خشکی کاهش می یابد، این در حالی است که در پژوهشی که توسط موسوی^[۱۳۵] و همکاران، (۲۰۰۹) بر روی ژنوتیپ­های مختلف بادام صورت گرفت مشاهده کردند که افزایش تنش خشکی تفاوت معنی­داری در میزان فسفر ریشه نشان نداد.
۲-۴- شناسایی ژن­های مرتبط به خشکی با بهره گرفتن از روش cDNA-AFLP
تعدادی از ژن­های ناشی از خشکسالی برای اولین بار در کاج (Pinus taeda .L) شناسایی شدند که از طریق تجزیه و تحلیل مقایسه­ ای با بهره گرفتن از cDNA-AFLP به­دست آمد و نتایج آن­ها نشان داد که اظها­رهای متفاوتی را در شرایط کمبود آب داشتند (چانگ^[۱۳۶] و همکاران، ۱۹۹۶). چانگ و همکاران قادر بودند یک درک و بینش کلی نسبت به رشته­ها و الگو­های بیان شده ناشی از تنش خشکی را ارائه دهند. هم­چنین برای شناسایی تعداد بیشتری از ژن­های پاسخ­گو به تنش خشکی بدون اساس و پایه علمی پیشین با بهره گرفتن از CDNA–AFLP در کاج بیابانی توسط دپس^[۱۳۷] و همکاران، (۲۰۰۳) مطالعاتی صورت گرفت که در طی این مطالعه ۴۸ ژن پاسخگو به خشکسالی شناسایی شدند و از این ۴۸ ژن بسیاری از پروتئین­های شناخته شده عملکرد آن­ها با فتوسنتز، متابولیسم کربوهیدرات­ها و سنتز دیواره سلولی گیاهی و دفاع مطابقت داشت. آزمایشات مشابهی با بهره گرفتن از روش cDNA-AFLP جهت شناسایی ژن­های پاسخگو به خشکسالی در برگ­های جوان ارقام مختلف بادام (Prunus amygdalus) صورت گرفت و متوجه شدند که ژن­های اظهار شده تحت تنش خشکسالی متفاوت بودند (کام­پلانس^[۱۳۸] و همکاران، ۲۰۰۱). لورنز و همکاران (۲۰۰۶)، با مطالعه­ ای که بر روی P. taeda L. تحت تنش خشکی انجام دادند توانستند ژن­های پاسخگو به خشکسالی را شناسایی کنند. در این بررسی cDNA-AFLP برای بررسی بیان ژن در P. taeda L. در تنش خشکی نشان داد که تغیراتی که در الگو­های بیان ژن در واکنش به خشکی صورت می­گیرد فقط بصورت کیفی است و کمی نیست (لورنز^[۱۳۹] و همکاران، ۲۰۰۶).
ژانگ^[۱۴۰] (۱۹۸۹) در مطالعه­ ای که بر روی گونه­ هندوانه ابوجهل Citrullus colocynthis انجام داد، متوجه شد که به دلیل دارا بودن سیستم ریشه­ای عمیق، گونه ­ای مقاوم در برابر خشکسالی است و گیاه را تحت تنش خشکی با بهره گرفتن از پلی­اتیلن گلیکول قرار دادند و در نهایت از cDNA-AFLP ریشه برای مطالعه­ بیان ژن­ها استفاده شد. نتایج نشان داد که هجده ژن وجود دارد که با مسیر­های متابولیکی هورمون­هایی مانند آبسزیک اسید، اسید سالسیلیک و اسید جاسمونیک در ارتباط بودند. هم­چنین مطالعه­ ای که روی Ammopiptanthus mongolicus در پاسخ به خشکی انجام شد، بیان ژن این گونه تحت تنش خشکسالی، سرما و ترکیبی از خشکسالی و تنش سرمایی در مدت زمان­های ۰، ۶، ۱۲، ۲۴ و ۴۸ ساعت پس از اعمال تنش­های فوق با بهره گرفتن از cDNA-AFLP مطالعه شد. در نهایت با بهره گرفتن از ۶۴ ترکیب پرایمری مختلف در کل ۴۰۹۳ قطعه cDNA جدا شد که ۳۹۵ باند خاص در میان ۴۰۹۳ باند مشاهده شد. ۳۹ قطعه بیان شده از نمونه­هایی بودند که تحت تنش خشکی قرار گرفتند و ۷۰ تا از قطعه­های بیان شده قابل تشخیص از نمونه­هایی بود که در سرما قرار گرفته بودند (وانگ^[۱۴۱] و همکاران، ۲۰۱۱).
کاربرد فنcDNA-AFLP بر روی گونه­ Festuca sp. نیز با کمک آنزیم­ های NSPI و Taq برای تشخیص ژن­های اظهار شده مورد استفاده قرار گرفت. تحت تنش خشکی در کل ۴۶۴ قطعه­ی مختلف در Festuca تولید شد (وانگ، ۲۰۰۵). برای تعیین بیان ژن و پاسخ­های فیزیولوژیکی و روابط درونی در صنوبر سیاه و سفید نیز نسبت به میزان دی­اکسیدکربن بالا، خشکسالی و ترکیبی از هر دو نیز مطالعه­ ای صورت گرفت که از هزاران رونوشت بیان شده در پاسخ به این تنش­ها بیش از ۱۶۰۰ ژن از چند مسیر وجود داشت (بیش از ۱۰ برابر) که بیان متفاوت بین شرایط کنترل و تحت تنش را داشتند. این نتایج به میزان زیادی باعث درک آن­ها در مورد پاسخ­های درختان به تغییرات آب و هوایی جهانی و در نهایت اثرات آن بر روی درختان گردید (راجورا و همکاران، ۲۰۱۱). در تحقیقی دیگر نیز که روی زمین­های برنج در دشت­های بالا و پایین با بهره گرفتن از cDNA-AFLP صورت گرفت، برنج­هایی که در دشت­های بالا بودند مقاومت بیشتری نسبت به تنش خشکی نشان دادند. نتایج نشان داد که بیش از ۹۰% از ژن­های بیان شده تحت تنش خشکی در دو ژنوتیپ برنج تحت تاثیر قرار نگرفتند و بیش از ۸% تنش در هر دو بیان و کمتر از ۱% بصورت ویژه در در دشت­های بالا یا پایین بیان شد. ۵۷ ژن بصورت خالص در دشت­های بالا و ۳۸ ژن در دشت­های پایین اظهار شد (گائو^[۱۴۲] و همکاران، ۲۰۰۹). طاهری (۱۳۸۴) مطالعه­ ای را بر روی گونه­ گندم، جهت بررسی الگوی بیان ژن با روش cDNA-AFLP تحت تنش خشکی انجام داد، در نهایت اختلاف زیادی در الگوی بیان ژن­ها بین تیمار­های مختلف خشکی در مقایسه با شرایط نرمال در بافت برگ مشاهده ننمود، ولی در بافت ریشه بخصوص بین تیمار­های مختلف خشکی، این اختلافات محسوس­تر بود. بنابراین بافت ریشه جهت بررسی الگو­های بیان ژن بین شرایط نرمال رطوبتی و تحت تنش مناسب­ترتشخیص داده شد.
در مطالعه­ ای که توسط گاپتو و همکاران (۲۰۱۲) صورت گرفت روش cDNA-AFLP برای شناسایی بیان ژن در پاسخ به خشکسالی در چای مورد استفاده قرار گرفت، در این مطالعه، خشکسالی به صورت مصنوعی القا شد که در نهایت قطعات به­دست آمده از ۱۰۸ رونوشت^[۱۴۳] که به صورت متفاوت در ژنوتیپ های مقاوم به خشکی بیان می­شدند، شناسایی شدند و از این بین ۸۹ مورد توالی یابی شدند. ۵۹ مورد از آنها همولوگ^[۱۴۴] (شبه) بودند. بررسی عملکرد این ژن­ها حاکی از ارتباط این ژن­ها با متابولیسم کربوهیدراتها، پاسخ به استرس، فرایند تغییر پروتئین­ها و ترجمه بود.
ویس و همکاران (۱۹۹۵) برای شناسایی ارقام مقاوم نیشکر در پاسخ به قارچ Ustilago مطالعاتی را انجام دادند که هدف از این مطالعه به­دست آوردن یک درک و بینش کلی نسبت به مکانیسم­های مقاومت با امکان جدا سازی قطعه­ای خاص از ژن با بهره گرفتن از نشانگر RFLPدر نقشه برداری بود. آن­ها از روش cDNA-AFLP برای شناسایی ژن­های مختلف در نیشکر استفاده کردند، در نهایت گونه­ های حساس و مقاوم شناسایی و توالی­های همسان از قطعات ژنتیکی جدا شده شناسایی شدند.
کوئلهو^[۱۴۵] و همکاران (۲۰۰۷) در طی مطالعه­ ای که روی مقاومت به بیماری قارچی phytopthera با cDNA-AFLP انجام دادند یک باند مرتبط با ژن­های مقاومت به بیماری در پایه­ های درختی گونه­ Quercus suber که آلوده به قارچ Phytophthora بود، شناسایی نمودند. هم­چنین نتایج تجزیهcDNA-AFLP ژن­های اظهارشده از گیاه گوجه فرنگی که شامل ژن­های مقاومت در برابر Cladosporium fulvum همراه با ژن Avr4 avirulence از یک قارچ گیاهی بود، در مقایسه با گیاهانی که در شرایط کنترل بودند، نشان داد که اظهارهای متفاوتی در الگوهای باندی وجود دارد (گابرلیس^[۱۴۶] و همکاران، ۲۰۰۶).
یک تاریخچه از تجزیه و تحلیل­های مولکولی نشان می­دهد که داشتن یک درک کلی از تاثیر خشکسالی بر ژنوم گیاهی می ­تواند یک تصویر کلی­تر از محل ژن­ها و پروتئین­های پاسخگو به خشکسالی به ما بد­هد. توجه کردن به چگونگی و درک این موضوع می ­تواند در حفظ سلامت جنگل و بهبود مزارع و بهره­وری از جنگل تاثیربگذارد (آلن^[۱۴۷] و همکاران، ۲۰۱۱). آنالیز ژنوم گسترده­ای از پاسخ درختان جنگلی نسبت به تنش خشکی می ­تواند به وسیله ابزارهای جدید و قوی­تری برای حفاظت از تنوع و اهداف انتخابی برای پرورش و یا اصلاح ژنوتیپ درختان جنگلی بهترین سناریوها از خشکسالی را در آینده نشان دهد.
فصل سوم:
روش تحقیق
۳-۱- نحوه جمع­آوری و کاشت بذر گونه­ های مورد مطالعه
با توجه به اینکه در منطقه رویشی زاگرس شمالی هر سه گونه بلوط پراکنش دارند، بنابراین با انجام جنگل گردشی در رویشگاه­های بلوط در شهرستان بانه، بذور سه گونه­ بلوط که شامل بلوط ایرانی Quercus brantii ،دارمازو Quercus infectoria و وی­ول Quercus libani بود درآبان ماه ۱۳۹۰جمع­آوری شدند و سپس بذور هر پایه درخت مادری در داخل گلدان پلاستیکی در فضای آزاد کاشته شدند (هرگلدان حاوی ۲-۱ بذر). گونه Q. infectoria به علت کم بودن تعداد تکرار در این بررسی لحاظ نگردید و تنها دو گونه دیگر مورد بررسی قرار گرفتند. پس از سبز شدن نهال­ها تا آبان سال بعد یعنی تا زمان تنش کمبود آب نهال­ها به طور کامل آبیاری شدند. در شهریور ماه، نهال­هایی با ارتفاع و شادابی یکسان از هر گونه برای اعمال تنش کمبود آب انتخاب شدند و به فضای گلخانه منتقل گردیدند.
۳–۲- روش اعمال تنش کمبود آب و برداشت نهال­ها:
قبل از اعمال تنش، ابتدا نهال­های سالم از هر گونه به ۴ دسته تیمار کنترل و تنش کمبود آب تقسیم شدند و برای هر تنش حداقل ۵ تکرار درنظرگرفته شد و برای تنش کمبود آب آبیاری نشدند تا به ظرفیت مزرعه­ای مورد نظر (۷۰٪، ۵۰٪ و ۳۰٪) رسیدند، ولی نها­ل­های کنترل هر روز آبیاری گردیدند تا محتوی آب خاک گلدان­ها در حدود ۱۰۰٪ ظرفیت مزرعه­ای نگه داشته شود. در این آزمایش پس از ۷ روز، ۱۰ روز و ۱۵ روز از قطع آبیاری، خاک گلدان­ها بتدریج به ۷۰٪، ۵۰٪ و ۳۰٪ ظرفیت مزرعه­ای رسیدند بدین منظور هر روز وزن گلدان­ها اندازه ­گیری شدند. برای محاسبه­ی ظرفیت مزرعه­ای خاک که به­عنوان بستر کاشت نهال­ها در نظر گرفته شده بود، ابتدا یک گلدان حاوی خاک با آب اشباع شد و سپس قسمت فوقانی آن جهت کاهش تبخیر سطحی با یک پلاستیک پوشانده و در محل سایه قرار داده شد. پس از ۲ روز پلاستیک برداشته و مقداری خاک از قسمت ۵-۶ سانتی­متری خاک گرفته و وزن شد. سپس این خاک در آون با دمای ۸۵ درجه سانتی ­گراد به مدت ۲۴ ساعت قرار گرفت و وزن خشک آن نیز اندازه ­گیری شد. مقدار درصد ظرفیت مزرعه­ای نیز بر اساس معادله ۳-۱ محاسبه شد.
معادله۳-۱

پس از محاسبه ظرفیت مزرعه­ای میزان آب گلدان­ها بر اساس معادله ۳-۲ محاسبه و سپس وزن تر و خشک خاک هر گلدان بر اساس معادلات ۳-۳ و ۳-۴ محاسبه و در نهایت از طریق مجموع وزن تر و خشک به­دست آمده وزن هر گلدان در تنش مورد نظر به­دست آمد. ظرفیت مزرعه­ای محاسبه شده برای تمام گلدان­ها ۳۰% بود.
معادله ۳-۲ =آب گلدان
معادله۳-۳ تنش(%) × آب گلدان = وزن تر
معادله ۳-۴ آب گلدان- وزن اشباع گلدان = وزن خشک
۳-۳- اندازه ­گیری پارامتر­های مرفولوژیکی و رویشی
تعداد کل برگ، تعداد برگ سبز در موقع برداشت نهال­ها شمارش و یادداشت شد. سپس نسبت تعداد برگ سبز به تعداد کل برگ محاسبه شد.
برای تعیین وزن تر .F.W^[148] اندام­های مختلف گیاه (برگ، ساقه و ریشه) نهال­های دو گونه در هر تنش با بهره گرفتن از ترازوی دیجیتالی حساس یک هزارم گرم اندازه ­گیری شدند.
برای تعیین وزن خشک .D.W^[149] اندام­های مختلف هر گونه شامل برگ، ساقه، ریشه ابتدا از هم جدا شده، سپس نمونه­ها به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۱۰۰ درجه سانتیگراد در دستگاه آون قرار گرفتند و سپس با بهره گرفتن از ترازوی دیجیتالی حساس یک هزارم گرم اندازه ­گیری شدند.
ارتفاع نهال از محل یقه تا جوانه انتهایی و ارتفاع کل ریشه با بهره گرفتن از خط­کش اندازه ­گیری شدند.
در نهایت نسبت اندام هوایی به زمینی خشک و تر (وزن اندام هوایی ساقه و برگ⁄ اندام زمینی ریشه) و نیز بیوماس تر و خشک (مجموع وزن برگ، ریشه و ساقه) محاسبه شدند.
۳-۴- اندازه ­گیری پارمتر­های فیزیولوژیک
۳-۴-۱- اندازه ­گیری محتوای نسبی آب(RWC)^[150]
جهت تعیین محتوای نسبی آب اندام­ها، نمونه­ برگ از میان برگ­های بالغ، نمونه ساقه از قسمت تحتانی ساقه و نمونه ریشه از میان ریشه ­های نازک انتخاب گردیدند. وزن ریشه، ساقه و برگ هر نهال بطور جداگانه اندازه ­گیری شد و به­عنوان وزن تر (FW) در نظر گرفته شد. سپس نمونه­ها به مدت ۲۴ ساعت در قوطی­های حاوی آب مقطر و در دمای اتاق قرار داده شدند تا به حالت اشباع خود برسند و پس از خشک کردن آب موجود روی آن­ها دوباره وزن شدند تا وزن اشباع (TW) به­دست آمد. در نهایت نمونه­های اشباع شده به مدت ۴۸ ساعت در آون با دمای ۸۰ درجه سانتی گراد قرار گرفتند و وزن خشک آن­ها (DW) اندازه ­گیری شد و میزان RWC اندام­ها بر اساس معادله ۳-۵ به­دست آمد (شریعت و عصاره، ۱۳۸۷؛ شونفلد و همکاران، ۱۹۸۸؛ سالوادور، ۲۰۰۴).
معادله ۳- ۵ RWC=((FW-DW)/(TW-DW))×۱۰۰
۳-۴-۲- اندازه ­گیری عملکرد فتوسیستم ∏
جدید­ترین برگ­های کاملا توسعه یافته و فوقانی از نهال­های منتخب برای برداشت در هر مرحله توسط دستگاه فلورمتر قابل حمل القا کننده پالس (OSI-FL,Optic-Sciences، ایالات متحده آمریکا) در فضای باز یک بار در شب قبل از برداشت به­عنوان تعیین عملکرد فتوسیستم ∏ در تاریکی و بار دیگر در صبح روز بعد، برداشت به­عنوان عملکرد فتوسیستم ∏ در روشنایی خوانده شدند. به این­صورت که ابتدا به گیاه مستقر در فضای باز در هر دو حالت تاریکی و روشنایی، نور فعال فتوسنتزی (AL) تابانده شد و بلافاصله برگ در معرض اولین پالس اشباع قرار گرفت و پارامتر­های فلوروسنس کلروفیل آن ثبت شد. اعداد قرائت شده شامل فلورسنس ضمیمه (F₀)، بیشترین فلوروسنس (F_m) و Fv/Fm بودند.
۳-۴-۳- اندازه ­گیری نرخ نشت الکترولیت
میزان نشت الکترولیت­ها از بافت­های مختلف به عنوان شاخصی برای آسیب غشای سیتوپلاسمی با بهره گرفتن از یک دستگاه هدایت سنج (EC متر) اندازه ­گیری شد. برای این منظور نمونه­هایی با وزن تقریبی ۵/۰ گرم از ریشه، ساقه و برگ با بهره گرفتن از تیغ تیز جدا شد و پس از آبکشی توسط آب مقطر در ۲۰ میلی لیتر آب مقطر در ظروف فالکون در بسته غوطه­ور گردید. پس از ۲۴ ساعت نگهداری در دمای ۴ درجه­ سانتی گراد هدایت الکتریکی ثبت شد (_۲۴EC) و سپس نمونه­ها در حمام آب گرم به مدت ۱ ساعت جوشانده شدند. پس از رسیدن دمای نمونه­ها به دمای اتاق، هدایت الکترولیت­ها مجددا اندازه ­گیری گردید و ماکزیمم هدایت الکتریکی (EC _Max) از این طریق ثبت گردید، سپس نسبت هدایت الکتریکی ۲۴ به ماکزیمم بر حسب درصد به عنوان شاخص آسیب غشایی محاسبه گردید (فیاض^[۱۵۱]، ۲۰۰۸).
۳-۴-۴- اندازه ­گیری تبادلات گازی برگ
به منظور اندازه ­گیری تبادلات گازی گیاه از دستگاه ADC (Bioscientific، انگلستان) استفاده شد. تمامی اندازه ­گیری­ها در ساعت ۱۰ تا ۱۲ صبح با میزان نور متفاوت صورت گرفت. در زمان اول با میزان تشعشعات فعال فتوسنتزی (PAR) 1000 میکرومول فوتون بر متر مربع در ثانیه و در زمان دوم با ۵۰۰ میکرو­مول فوتون بر متر مربع در ثانیه صورت گرفت. بدین منظور برگ­های کاملا توسعه ­یافته بالایی از هر نهال­ یکساله مورد نظر در درون محفظه دستگاه قرارگرفت. به منظور تصحیح سطح برگ، از برگ­های قرار داده شده در اتاقک برگ با بهره گرفتن از سطح مشبک سطح آن­ها تعیین گردید. اندازه ­گیری در ۲ روز با فاصله زمانی ۵ روزه انجام گرفت. سپس پارامتر­های متعددی مستقیماً از دستگاه جمع­آوری و یا به صورت غیرمستقیم و از طریق روابط تجربی زیر شامل نرخ فتوسنتز خالص (A) (میکرومول دی­اکسیدکربن بر متر مربع در ثانیه)، هدایت روزنه­ای(gs) (میلی­مول آب بر مترمربع در ثانیه)، تعرق(E) (میلی مول آب بر متر مربع در ثانیه) ، تراکم دی‌اکسیدکربن محیطی (c_ref)، تراکم دی‌اکسیدکربن زیر روزنه­ای (c_i) (میکرو مول/ مول)، نسبت دی‌اکسید کربن درون سلولی به محیطی (c_i/c_ref)، هدایت مزوفیلی (مول در مترمربع در ثانیه) بر اساس معادله ۳-۶، کارایی مزوفیلی (میکرو مول در متر مربع در ثانیه / مول در میلی مول آب) براساس معادله ۳-۷، کارایی مصرف آب (WUE) (میکرو­مول دی اکسید کربن بر مول آب) بر اساس معادله ۳-۸ (احمدی و سی وسه مرده^[۱۵۲]، ۲۰۰۵) و کارایی مصرف آب برگ (WUEL) (میکرومول دی­اکسیدکربن در سانتی­متر مربع / متر مربع در ثانیه) بر اساس رابطه ۳-۹ تعیین گردید.