• پس از نمایان شدن باندها، کاغذ با آب مقطر چند بار شستشو داده شد و سپس کاغذ را خشک کرده و در جای تاریک نگهداری گردید.

فصل سوم نتایج
۳-۱ سنتز ژن gcsf
cDNA کد کننده پروتئین GCSF پس از بهینه سازی کدونها برای بیان در سلول مخمری به یکی از شرکت های مرتبط سفارش داده شد و توالی سنتز شده در وکتور کلونینگ pGH به گروه تحویل داده شد (شکل ۳-۱).

شکل ۳-۱ طرح شماتیک وکتور کلونینگ حاوی ژن gcsf
۳-۱-۱ PCR اختصاصی بر روی ژن gcsf
۳-۱-۱-۱طراحی پرایمرهای اختصاصی ژن gcsf
با توجه به این که جایگاه برش آنزیم‌های BamHΙ و HpaI در توالی ژن هدف، gcsf، و نیز وکتور بیانی طراحی شده وجود ندارد، این دو جایگاه بر روی توالی پرایمرهای F و R تعبیه شدند. طراحی پرایمرها با بررسی نکات کلیدی در زمینه عدم تشکیل فرم سنجاق سری ، دایمرهای پرایمری و سایر ساختارهای ثانویه با بهره گرفتن از نرم‌افزار genrunnr انجام شد. نتایج حاصل از بررسی پرایمرها در این نرم‌افزار در شکل‌های ۳-۲ الف و ب آورده شده است.

(الف) (ب)
شکل۳-۲ بررسی توالی پرایمرهای F (الف) و R (ب) ژن gcsf.
۳-۱-۱-۲ بهینه ‌سازی واکنش PCR
گرادیان PCR بهترین دمای اتصال پرایمرها و تکثیر ژن gcsf را ۶۰ درجه سانتی گراد نشان داد (شکل ۳-۳).
۸ ۷ ۶ ۵ ۴ ۳ ۲ ۱
شکل ۳-۳ PCR گرادیان ژن مقاومت به gcsf
چاهک ۷-۱: محصول PCR در دماهای ۵۰ تا ۶۰ درجه سانتی گراد
چاهک ۵: مارکر DNA (kb1)
چاهک ۸: کنترل منفی PCR
۳-۲ کلون نمودن ژن gcsf در وکتور بیانی هانسونلا
۳-۲-۱ هضم آنزیمی وکتور کلونینگ pGH-gcsf و وکتور بیانی pHan
به دنبال هضم آنزیمی این وکتورها با آنزیمهای BamHI و HpaI، در مورد وکتور کلونینگ، بر روی ژل آگارز قطعه ژنی gcsf به طول تقریبی bp615 و وکتور کلونینگ pGH به طول تقریبی bp2900 مشاهده شد در حالیکه در مورد وکتور بیانی، وکتور خطی شده ای به طول حدوداً ۶۵۰۰ نوکلئوتید بر روی ژل ظاهر گردید (شکل ۳-۴).
۵ ۴ ۳ ۲ ۱
شکل ۳-۴ هضم آنزیمی وکتورهای pGH-gcsf و pHan با آنزیم های HpaI و BamHI
چاهک ۱: مارکر DNA (kb1)
چاهک ۲: وکتور هضم نشده pGH-gcsf
چاهک ۳: وکتورpGH-gcsf هضم شده با HpaI و BamHI (ژن gcsf به طول bp615)
چاهک ۴: وکتور هضم نشده pHan
چاهک ۵: وکتور pHan هضم شده با HpaI و BamHI (به طول تقریبی bp6500)
۳-۲-۲ بررسی کلونهای نوترکیب pHan-gcsf
پس از هضم وکتورهای فوق با دو آنزیم BamHI و HpaI، وکتور بیانی و قطعه ژنی gcsf از ژل آگارز تخلیص شده و پس از کلونینگ و انتقال محصول واکنش لیگاسیون به سلول‌های مستعد E. coli TOP10 F’، غربالگری کلونهای نوترکیب به روش های زیر انجام شد.
۳-۲-۲-۱ بررسی کلونها به روش سریع
کلونهای حاوی وکتورهای سنگین تر از وکتور بیانی pHan بدون ژن الحاقی بر روی ژل آگارز، به عنوان کلونهای مشکوک گزارش گردیدند (شکل ۳-۵).
۱ ۲ ۳ ۴ ۵ ۶ ۷ ۸ ۹ ۱۰ ۱۱ ۱۲
شکل ۳-۵ بررسی کلونها به روش سریع
چاهک های ۱۲-۱: کلونهای مشکوک آماده شده (از کلونهای ۳، ۸ و ۱۰ استخراج پلاسمید صورت گرفت).
۳-۲-۲-۲ انجام PCR ژن gcsf بر روی پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf
یکی از کلونهای تأیید شده از مرحله قبل در محیط LB مایع کشت داده شده و استخراج پلاسمید از آن صورت گرفت. وجود ژن gcsf در این پلاسمید با انجام PCR اختصاصی تأیید گردید (شکل ۳-۶).
۱ ۲ ۳ ۴
شکل ۳-۶ PCR ژن gcsf بر روی پلاسمید نوترکیب pHan-gcsf
چاهک ۱: کنترل مثبت PCR
چاهک ۲: کلون نوترکیب شماره ۳ با باند gcsf (bp615)
چاهک ۳: کنترل منفی PCR
چاهک ۴: مارکر DNA (kb1)
۳-۲-۲-۳ هضم آنزیمی وکتور تأیید شده pHan-gcsf
برای تأیید نهایی این کلون، پلاسمید استخراج ‌شده با BamH، EcoRI و HpaI مورد هضم آنزیمی قرار گرفت و محصول آن بر روی ژل آگارز ۱% الکتروفورز گردید (شکل ۳-۷).

۱ ۲ ۳ ۴ ۵ ۶ ۷ ۸ ۹ ۱۰ ۱۱ ۱۲