این عمل به منظور یافتن حد اکثر دوز غیر توکسیک عصاره برای سلول، با دو متد رنگ آمیزی حیاتی تریپان بلو و MTT assay انجام شد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۱۶-۱ روش تریپان بلو:
این روش برای شمارش و تعیین نسبت سلول های مرده و زنده استفاده می شود. تریپان بلو یک رنگ حیاتی می باشد که سلول های زنده رنگ را نپذیرفته و بدون رنگ باقی می مانند اما سلول های مرده چنین قابلیتی را نداشته و در نتیجه رنگ را پذیرفته و به رنگ آبی مشاهده می شوند.
روش کار:
۱– در دو پلیت ۲۴ حفره ای کشت سلول Hela انجام شد تا منولایر سلولی تشکیل گردد.
۲- پس از تخلیه محیط هر چاهک، سلول ها دو بار توسط PBS شسته شدند.
۳- رقت مختلف از عصاره گیاهی مورد نظر از محلول استوک در محیط کشت DMEM حاوی ۲ درصد سرم تهیه شد (در لوله های استریل) از هر رقت ۵/۰ میلی لیتر در هر حفره اضافه شد (برای هر رقت، ۴ چاهک در نظر گرفته شد).
۴- چاهک نیز به عنوان کنترل سلول در نظر گرفته شد که به آن محیط DMEM حاوی ۲% سرم اضافه گردید.

1. 1. از هر رقت در فواصل زمانی ۲۴، ۴۸، ۷۲، ۹۶ ساعت یک چاهک برای رنگ آمیزی انتخاب شده و محیط رویی سلول ها به یک میکروتیوب منتقل شد. با این کار اگر در طی انکوباسیون سلول مرده ای از کف فلاسک جدا شده باشد در مایع رویی وجود داشته و در بررسی های بعدی در نظر گرفته می شد.

1. 1. سلول ها با ۵۰۰ میکرولیتر PBS شسته شده و PBS به داخل میکروتیوب ذکر شده منتقل گردید.

1. 1. به هر چاهک ۲۰۰ میکرولیتر تریپسین اضافه و به آرامی تکان داده شد تا تمام سطح سلول ها را پوشش داده و سپس درب پلیت بسته و در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۲ دقیقه انکوبه گردید.

1. 1. تریپسین خارج شده، به هر چاهک ۵/۰ میلی لیتر PBS اضافه شد و سپس سلول ها به طریق پیپت کردن از کف چاهک کنده شده و سوسپانسیون سلولی فوق به میکروتیوب قبلی (حاوی محیط رویی کشت اولیه) انتقال داده شد.

1. 1. میکروتیوب فوق در سانتریفوژ با دور ۱۵۰۰ و زمان ۵ دقیقه قرار گرفت تا سلول ها در ته میکروتیوب رسوب نمایند.

۱۰- محیط رویی سلول ها خارج شده و به آن ۱۰۰ میکرولیتر PBS و ۵۰ میکرولیتر رنگ حیاتی تریپان بلو اضافه و به آرامی با سمپلر مخلوط شده تا سوسپانسیون یکنواخت بدست آید.
۱۱- سلول ها توسط لام نئوبار شمارش شده و درصد سلول های زنده با فرمول زیر یه دست آمد.
۳-۱۶-۲ روش MTT assay :
تست MTT روشی برای تعیین زنده بودن (viability) سلول ها است. تمام مراحل آزمایش از ابتدای کشت سلول Hela تا قرائت با فتومتر در یک میکروپلیت ۹۶ خانه ای انجام شد. سوبسترای واکنش، نمکهای محلول تترازولیوم می باشند، که مهمترین آنها نمک (MTT)
۳-(۴,۵ dimethylthiazol-2-yl)5-diphenyl-terazolium bromide است. نمک MTT توسط سیستم سوکسینات تترازولیوم ردوکتاز که یکی از آنزیم های چرخه تنفسی در میتوکندری است و فقط در سلول های زنده یافت می شود، شکسته شده و منجربه تشکیل ماده نامحلول (فورمازان) شده و در طی آزمایش با تعداد سلول هایی که از نظر متابولیک فعال هستند رابطه مستقیم دارد، فورمازان در آب نامحلول بوده و به صورت کریستال هایی با میکروسکوپ معمولی قابل مشاهده هستند و با بهره گرفتن از حلال هایی چون ایزوپروپانول اسیدی و یا DMSO حل شده و به ترکیب رنگی تبدیل می شود و ترکیب رنگی فوق مورد رنگ سنجی قرار می گیرد.
بدین ترتیب میزان جذب نوری حاصل از رنگ ایجاد شده مربوط به سلول های در معرض عصاره و همچنین مربوط به سلول های کنترل با بهره گرفتن از دستگاه الایزا Reader در طول موج ۵۴۰ نانومتر اندازه گیری شده و نسبت جذب نوری سلول های در معرض عصاره به سلول های کنترل محاسبه می گردد و عدد بدست آمده از نسبت فوق در عدد ۱۰۰ ضرب شده و بدین ترتیب درصد سلول های زنده در سلول های هر چاهک مشخص می گردد.
روش انجام تست MTT:
مراحل این تست به شرح زیر انجام شد:

1. 1. فلاسک حاوی منولایر سلول Hela را با PBS شستشو داده و به سلول ها محلول تریپسین اضافه شد و به محض گرد شدن سلول ها تریپسین از فلاسک خارج گردید.

1. 1. سلول ها با ۲میلی لیتر محیط DMEM بدون سرم و با عمل پیپت کردن به صورت یک سوسپانسیون سلولی یکنواخت تبدیل شد.

1. 1. ۱۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی برداشته شده و برای بدست آوردن تعداد کل سلول ها در داخل یک میکروتیوب ریخته و توسط لام نئوبار شمارش شد.

1. 1. تعداد یک پلیت ۹۶ خانه ای در نظر گرفته شد و در هر چاهک از پلیت ۹۶ خانه ای، تعداد ۱۰۰۰۰ سلول در ۲۰۰ میکرولیتر محیط DMEM حاوی ۱۰% سرم کشت داده شد .

1. 1. پس از ۴۸ ساعت از انکوباسیون و تشکیل منولایر سلولی در چاهک ها ۳ رقت از عصاره ی گیاه مورد آزمایش همراه با ۲% سرم به سلول های هر چاهک اضافه شد. برای هر رقت ۳ چاهک از پلیت ۹۶ خانه ای در نظر گرفته شد و ۳ چاهک نیز بعنوان کنترل سلول در نظر گرفته شد.

1. 1. پس از گذشت ۹۶ ساعت در پلیت ۹۶ خانه ای سلول ها را با PBS شستشو داده و به سلول های هر چاهک ۲۰ میکرو لیتر محلول MTT و ۸۰ میکرولیتر محیط DMEM اضافه شد (محلول MTT با اضافه کردن ۰۰۵/۰ گرم از پودر MTT به یک میلی لیتر محلول PBS تهیه گردید).

1. 1. پس از ۴ ساعت انکوباسیون در دمای ۳۰ درجه سانتی گراد و تشکیل کریستال های فورمازان، محیط رویی به آرامی خارج و به هر چاهک ۱۰۰ میکرولیتر DMSO برای حل شدن کریستال ها اضافه شد.

1. 1. پلیت به مدت ۱۵ دقیقه Shake گردید.

1. 1. میزان جذب هر چاهک در طول موج ۵۴۰ nm اندازه گیری و ثبت گردید.

1. 1. میانگین OD مربوط به هر ۳ چاهک که اختصاص به یک رقت خاص داشت محاسبه گردید.

1. 1. میانگین OD مربوط به ۳ چاهک که بعنوان کنترل در نظر گرفته شده بود نیز محاسبه شد.

1. 1. با تعیین نسبت میانگین OD مربوط به هر رقت به میانگین OD چاهک های کنترل و ضرب عدد حاصل در عدد ۱۰۰، درصد سلول های زنده مربوط به هر رقت بدست آمد.

۳-۱۷ تاثیر مستقیم عصاره بر ویروس HSV1:
در این مرحله به بررسی خواص ضد ویروسی عصاره گیاهی به طریق تاثیر مستقیم عصاره بر روی ویروس خارج از سلول پرداخته شد. برای این کار در زمان های مختلف ۰ ، ۱، ۲، ۳ و ۴ ساعت، بالاترین غلظتی از عصاره گیاهی که فاقد سمیت برای سلول Hela بود با مقدار مشخصی ویروس هرپس سیمپلکس تیپ یک ( ۱۰۰ TCID50 ) مجاور شده و در دمای ۴ درجه سانتی گراد قرار داده شد و پس از گذشت زمان های فوق، از آن مقدار مشخصی برداشت و به جهت مشخص کردن میزان کاهش عفونت زایی ویروس به سلول های Hela در چاهک های پلیت ۲۴ خانه ای تلقیح شد و بعد از ۴۸ ساعت از مایع رویی از کشت سلولی فوق نمونه برداری و تیتر ویروس هر چاهک به طور جداگانه به روش TCID50 مشخص گردید. در موازات این کار از همان مقدار ویروسی که در بالا اشاره شد (۱۰۰ TCID50) ویروس در محیط DMEM فاقد عصاره تهیه شد و مشابه تست فوق در زمان های مورد اشاره به سلول های Hela در چاهک های پلیت ۲۴ خانه ای تلقیح شد و بعد از ۴۸ ساعت از مایع رویی از کشت فوق نیز نمونه برداری و تیتر ویروسی مشخص گردید. این کار به جهت کنترل ویروس صورت گرفت تا کاهش تیتر ویروس در دمای ۴ درجه سانتی گراد در شرایط بدون عصاره گیاهی مورد سنجش قرار گیرد.
روش کار:

1. 1. در ۲ میلی لیتر محیط DMEM حاوی بالاترین غلظت غیر توکسیک عصاره، مقدار ۱۰۰ TCID50 سوسپانسیون ویروسی تهیه شد.

1. 1. در زمان های مختلف ( ۰، ۱، ۲، ۳ و ۴ ساعت) چاهک های پلیت ۲۴ خانه ای را شسته و ۲۰۰ میکرولیتر سوسپانسیون ویروسی فوق تلقیح گردید. (در طی این مدت سوسپانسیون ویروسی در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شد) پس از تلقیح سوسپانسیون ویروس، پلیت ۲۴ خانه ای جهت جذب ویروسی به انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد منتقل گردید.

1. 1. پس از یک ساعت جذب ویروسی محیط رویی سلول خالی و سلول ها شسته شد و به میزان۱۰۰۰ میکرولیتر محیط DMEM حاوی ۲% سرم افزوده شد. ( مشابه همین کار در محیط DMEM فاقد عصاره گیاهی به عنوان کنترل نیز انجام شد).

1. 1. بعد از ۴۸ ساعت از مایع رویی کشت هر چاهک مورد آزمایش نمونه برداری شد و تیتر ویروسی در پلیت ۹۶ خانه ای حاوی منولایر سلولی Hela به روش TCID50 تعیین تیتر گردید.

۳-۱۸ اثر مهارکنندگی عصاره در غلظت های مختلف بر تکثیرHSV-1 :
این عمل به منظور بررسی اثر عصاره در غلظت غیر توکسیک و غلظت پایین تر از آن بر ویروس جذب شده در سلول انجام شد تا تاثیر غلظت های مختلف عصاره در تکثیر ویروس مشخص گردد.
روش کار:

1. ابتدا یک پلیت ۲۴ خانه ای حاوی منولایر یکنواخت سلولی فراهم گردید.