شکل ۲-۲۲٫ روز سوم زخم (فاز التهابی) ۶۶
شکل ۲-۲۳٫ روز پنجم زخم (مرحله‌ی ری اپیتلیالیزاسیون و رگ‌سازی) ۶۶
شکل ۲-۲۴٫ کنترل مستقیم و غیر مستقیم ری اپیتلیزاسیون، آنژیوژنز و فعالیت فیبروبلاست‌ها توسط ماکروفاژها ۷۲
شکل ۲-۲۵٫ اثر سلول‌های مختلف در ترمیم زخم ۷۳
شکل ۲-۲۶٫ مدل فرضی از نقش گونه‌های واکنشگر اکسیژن در مکانیسم سیگنال‌دهی فاکتور رشد اپیدرمی در سلول‌های اپیتلیال ۸۰
شکل ۲-۲۷٫ مدلی فرضی برای تنظیم ساخت کلاژن ۸۴

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

شکل ۳-۱٫ احیای کلرومتریک XTT با آنزیم‌های سلولی ۹۴
شکل ۳-۲٫ نگهداری از حیوانات آزمایشگاهی ۱۰۱
شکل ۳-۳٫ نحوه قرارگیری موش‌های آزمایشگاهی در قفس‌های مخصوص ۱۰۵
شکل ۳-۴٫ روز صفر پس از اجرای الگوی زخم ۱۰۷
شکل ۳-۵٫ روزهای مختلف پس از اجرای الگوی زخم ۱۰۸
شکل ۳-۶٫ نحوه گرفتن بیوپسی از محل زخم و تقسیم‌بندی نمونه‌ها به منظور انتقال به آزمایشگاه‌های بیوشیمی و پاتولوژی ۱۰۹
شکل ۴-۱٫ عکس‌های حاصل از نمونه‌های پاتولوژیک ۱۳۴
خلاصه فارسی
اندوتوکسین‌ها از عمده‌ترین فاکتور‌های ویرولانس باکتری‌های گرم منفی هستند که به دلیل اثرات ایمونولوژیکی، پاتو فیزیولوژیکی و فارماکولوژیکی بر سلول‌های یوکاریوتی، مورد توجه قرار گرفته‌اند. ترمیم زخم ممکن است به دلیل نقص در مولکول‌های میانجی متوقف شود. لیپو پلی ساکارید (LPS) یکی از اصلی‌ترین محرک‌های تولید میانجی‌های التهابی به شمار می‌آید. هدف اصلی این تحقیق، بررسی اثر تجویز موضعی LPS سالمونلا انتریکا بر زخم تجربی ایجاد شده در پوست موش Balb/c و همچنین اثر آن بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست پوست می‌باشد. نمونه‌گیری از بافت‌های پوستی مربوط به گروه‌های شاهد و تیمار طی روز‌های ۱، ۲، ۳ و ۷ بعد از ایجاد زخم، به منظور بررسی‌های بیوشیمیایی و پاتولوژیکی انجام شد. میزان حیات سلولی با بهره گرفتن از روش XTT برای سلول‌های فیبروبلاست صورت گرفت. زخم‌های تیمار شده با LPS (100μg) نسبت به گروه شاهد، افزایش ارتشاح سلول‌های التهابی به محل زخم و افزایشی جزئی در میزان ضخامت لایه‌ی اپیتلیوم نشان دادند. سنجش سیکلو اکسیژناز-۲ (COX-2)، هیدروژن پراکسید (H₂O₂) و نیتریک اکسید (NO) به منظور اثر احتمالی آنها در ترمیم زخم مورد ارزیابی قرار گرفت. در سنجش‌های بیوشیمیایی میزان NO، COX-2، H₂O₂ افزایش یافت (P˂۰٫۰۰۱). بر اساس آزمون ANOVA، در بررسی میزان حیات سلول‌های فیبروبلاست تفاوت معنادار بین گروه‌های شاهد و تیمار مشاهده شد که البته این تفاوت وابسته به دوز مصرفی LPS و مدت زمان انکوباسیون بود. نتایج نشان می‌دهند که LPS با تحریک تولید میانجی‌های التهابی، توانایی افزایش مرحله‌ی التهابی ترمیم زخم را دارد. مطالعات گسترده‌تر با طراحی دوز‌های مختلف از LPS استرین‌های باکتریایی مختلف، فهم بهتری از مکانیسم اثر LPS در ترمیم زخم در مدل حیوانی نشان خواهد داد. به احتمال زیاد این یافته‌ها در توسعه‌ی روش‌های جدید برای درمان زخم‌ها ارزشمند خواهد بود.
واژگان کلیدی: زخم، لیپو پلی ساکارید سالمونلا انتریکا، التهاب، نیتریک اکسید، سیکلو اکسیژناز-۲، هیدروژن پر اکسید، فیبروبلاست
فصل اول
کلیات
۱-۱٫ بیان مسئله
سالمونلا انتریکا از دسته‌ی باکتری‌های گرم منفی بی‌هوازی اختیاری داخل سلولی است که سالانه باعث ۱٫۳ میلیارد مورد بیماری در جهان می‌شود. از میان ۶ زیر گونه‌ی سالمونلا که بر اساس تفاوت در فلاژل، کربوهیدرات و لیپوپلی ساکارید دسته‌بندی شده‌اند، بیش از ۲۵۰۰ سرووار مربوط به سالمونلا انتریکا شناخته شده است. سالمونلا می‌تواند طیف وسیعی از سلول‌ها مثل دندریتیک سل‌ها، ماکروفاژها، هپاتوسیت‌ها، نوتروفیل‌ها، کولونوسیت‌ها و سلول‌های اپی‌تلیال را مورد حمله قرار دهد. LPS سالمونلا از محرک‌های قوی پاسخ التهابی در ماکروفاژ‌ها محسوب می‌شود.
التهاب پوستی و نکروز هموراژیک که به توسط لیپوپلی ساکارید و لیپید A باکتری‌ها ایجاد می‌شوند، در موش مورد مطالعه قرار گرفته است. با تزریق داخل پوستی LPS S-form و لیپید A سالمونلا تیفی موریوم به موش ddy، بعد از ۱۲ ساعت میزان نفوذپذیری رگها در آن منطقه تغییر می‌کند و باعث ادم می‌شود و به دنبال آن بعد از ۲۴ تا ۷۲ ساعت منجر به نکروز هموراژیک می‌شود. القای التهاب پوستی توسط LPS و لیپید A به ترتیب از بیشترین تاثیر تا کمترین تاثیر بدین صورت هستند:
Re-form LPS > Rc-form LPS > lipid A > Ra-form LPS > S-form LPS
ادم حاصل از تزریق LPS در پاسخ به فعالیت کمپلمان ایجاد می‌شود در حالیکه واکنش‌های هموراژیک به فعالیت سلول‌های هدف مثل ماکروفاژ‌ها و سلول‌های اندوتلیال درون رگی مربوط می‌شوند. جزیره‌ی بیماریزایی ۲ سالمونلا (SPI2) برای فرار از ماکروفاژ‌ها و ایجاد عفونت سیستمیک در موش‌ها لازم می‌باشد. سالمونلا می‌تواند باعث فعال شدن ERK1/2 با واسطه‌ی SPI-2 شود و به دنبال القای تولید PGE2 و PGI2 در ماکروفاژ‌ها منجر به افزایش بیان COX-2 (سیکلواکسیژناز-۲) شود. سایتوکاین‌ها و ایکوزانوئیدهایی چون پروستاگلاندین‌ها و لوکوترین‌ها در نحوه‌ی عملکرد ماکروفاژ‌ها تاثیر می‌گذارند. پروستاگلاندین‌ها (PGs) که در انواع مختلفی از سلول‌ها ساخته می‌شوند از جمله میانجی‌های مهم التهاب و پاسخ ایمنی محسوب می‌شوند. مرحله‌ی محدود کننده‌ی سرعت در سنتز PGs توسط COX کاتالیز می‌شود. COX-2 در انواع کمتری از سلول‌ها بیان می‌شود ولی به شدت با محرک‌های مختلفی مثل میتوژن‌ها، سایتوکاین‌ها، هورمون‌ها و انکوژن‌ها القا می‌شود، همچنین لیپو پلی ساکارید‌ها در القای بیان COX-2 در مونوسیت‌ها و ماکروفاژ‌ها سهیم هستند که این نوع از القا که با LPS ایجاد می‌شود، توسط مسیر سیگنال‌دهی انتقالی پروتئین کیناز تحریک شده با میتوژن (MAPK) تنظیم می‌شود. پروتئین SpiC کد شده توسط SPI-2 بوسیله‌ی سیستم ترشحی تیپ III به سیتوزول ماکروفاژ‌هایی که با سالمونلا آلوده شده‌اند منتقل می‌شود و با پروتئین‌های میزبان همچون TassC و Hook3 که در تردد سلولی نقش دارند وارد واکنش می‌شود. همچنین در مطالعاتی نقش SPI-2 در مهار فیوژن SCV (واکوئل‌های حاوی سالمونلا) با وزیکول‌های مسیر اندوسیتیک مثل وزیکول‌های حاوی نیتریک اکساید سنتتاز القایی (iNOS) و NADPH اکسیداز به اثبات رسیده است.
هنگامی‌که سالمونلا انتریکا سلول‌های پستانداران را مورد هجوم قرار می‌دهد سیگنال‌هایی را فعال می‌کند و منجر به افزایش بیان میانجی‌های التهابی می‌شوند. یکی از این میانجی‌ها، نیتریک اکسید (NO) است که تولید آن تحت کنترل آنزیم نیتریک اکسید سنتتاز القایی(iNOS) می‌باشد. این آنزیم در پوست در کراتینوسیت‌ها، فیبروبلاست‌ها، سلول‌های لانگرهانس و اندوتلیال‌ها القا می‌شود. تیپ وحشی سالمونلا می‌تواند هم میزان پروتئین iNOS و هم میزان mRNA مربوطه را در سلول‌های ماکروفاژ موش افزایش دهد. استرین‌های موتانت سالمونلا که فاقد SPI-1 هستند سیستم ترشحی تیپ III آنها کد نمی‌شود و همچنین استرین‌هایی که فاقد مولکول‌های تهاجمی ‌SipB, SipC, SipD هستند نمی‌توانند باعث القای iNOS شوند. نشت پلاسما در پوست موش به کمک جمع‌ آوری موضعی pontamine sky blue در محل تزریق LPS اندازه‌گیری می‌شود. این مطالعات نشان می‌دهند که بالا رفتن میزان نفوذپذیری رگ‌ها بوسیله‌ی LPS، به میانجی‌گری NO حاصل از iNOS، ایکوزانوئید‌ها، هیستامین و TNF-α صورت می‌گیرد. تولرانس ایجاد شده بر علیه تغییرات نفوذپذیری که توسط LPS در رگ‌ها رخ می‌دهد با القای iNOS میانجی‌گری می‌شود نه با افزایش رهاسازی کورتیکواستروئید‌های اندوژنوز. نشت پلاسما در پوست بوسیله‌ی LPS حداکثر تا ۲ ساعت رخ می‌دهد. تزریق زیر جلدی LPS هم در موش‌های تیپ وحشی و هم در موش‌های فاقد iNOS می‌تواند باعث افزایش نشت پلاسما شود به طوریکه اثر LPS در موش‌های فاقد iNOS نسبت به تیپ وحشی کمتر است. این نشان می‌دهد که LPS در افزایش میزان پروتئین iNOS در پوست رت نقش دارد. نتایج نشان می‌دهند که افزایش نفوذپذیری رگها توسط LPS در موش‌های وحشی بطور عمده وابسته به تولید NO به وسیله‌ی iNOS می‌باشد ولی در موش‌های فاقد iNOS،LPS با مکانیسمی‌مستقل از iNOS میزان نفوذپذیری رگها را تغییر می‌دهد که این کار را به واسطه‌ی میانجی‌هایی مثل ایکوزانوئید‌ها، هیستامین و TNF-α انجام می‌دهد. ایکوزانوئید‌ها که به طور عمده توسط COX-2 تولید می‌شوند، نقش خود را در نشت پلاسما در موش‌های فاقد iNOS و موش‌های وحشی ایفا می‌کنند. همچنین با مطالعاتی که روی دیفن هیدرامین، هیستامین و آنتی‌بادی ضد TNF-α انجام گرفته است، نقش آنها در افزایش نفوذپذیری رگها آشکار شده است. دلیل انتخاب COX-2 و iNOS در این تحقیق به دلیل القا پذیر بودن آنها می‌باشد، در ضمن این دو فاکتور القایی اثر سینرژیسمی‌بر روی یکدیگر دارند و افزایش یکی از آنها باعث افزایش دیگری و همینطور کاهش یکی از آنها باعث کاهش دیگری می‌شود.
فرایند التیام زخم جلدی مستلزم واکنش بین سلول‌های موجود در درم و اپیدرم و رهاسازی میانجی‌های شیمیایی از سلول‌های التهاب‌آور، فیبروبلاست‌ها و کراتینوسیت‌ها می‌باشد. این فرایند پیچیده شامل مهاجرت سلول‌ها، تکثیر سلول‌ها، حذف ماتریکس خارج سلولی، آنژیوژنز و ترمیم می‌باشد. امروزه زخم‌های مزمن یا زخم‌هایی که از توانایی ترمیم پائینی برخوردارند، از مشکلات مهم بالینی به شمار می‌روند و از آنجایی که در جوامع امروزی شیوع این نوع زخم‌ها با افزایش رخداد بیماری‌هایی مثل چاقی، دیابت ملیتوس و زخم بستر به طور پیشرونده‌ای بالا می‌رود، لذا تلاش‌های زیادی برای معرفی داروهای جدید با منشاء گیاهی یا شیمیائی که فرایند ترمیم را تسریع می‌بخشند، صورت می‌گیرد. بهبود زخم در برخی از بیماری‌ها و اختلالات مزمن به یکی از چالش‌های علم پزشکی تبدیل شده است. به همین دلیل ترکیبات جدیدی که به منظور تسریع التیام زخم تهیه می‌گردند، مورد استقبال واقع می‌شوند.
اکسیدانت‌ها با سیگنال‌دهی و فراهم آوردن سیستم دفاعی بر علیه میکروارگانیسم‌ها نقش مهمی‌در التیام زخم دارند. همچنین با تکیه بر شواهدی که از مطالعات انسانی و حیوانی بدست آمده، می‌توان اثر سودمند NO در التیام زخم‌ها را بیان کرد که این موضوع به دلیل اثری است که NO در آنژیوژنز، التهاب، گشاد کردن رگ‌ها، تکثیر سلولی، تعمیر، ایمنی، تمایز سلولی و آپوپتوز می‌گذارد (۸ و ۱۲). تحقیقاتی که در این زمینه انجام گرفته‌اند نشان می‌دهند که ژن درمانی NOS و SODبه موجب افزایش NO و کاهش سوپراکسید، در تسریع التیام زخم‌های مقاوم به خصوص زخم دیابتی نوع ۱ نقش دارند (۷ و ۱۳). همچنین نقش COX-2 در تکثیر و تمایز کراتینوسیت‌ها به دنبال خراشیدگی جزئی در پوست به اثبات رسیده است.
۱-۲٫ ضروریت انجام تحقیق
بر اساس بررسی‌های انجام شده در سطح کتابخانه‌ای و اینترنتی، این موضوع برای اولین بار در کشور مورد بررسی قرار می‌گیرد. از دلایل انتخاب این موضوع می‌توان به توجه کمی ‌که به پوست از لحاظ میکروبیولوژی شده است اشاره کرد و همانطور که می‌دانیم باکتری‌های گرم منفی همچون سالمونلا با سرووار‌های متعددی که دارند در محیط پیرامون ما به وفور حضور دارند و باعث بیماریزایی می‌شوند، پس احتمال اینکه از طریق زخم هم وارد پوست شوند وجود دارد، از سویی دیگر در ایران میزان استفاده از لوازم آرایشی نیز بسیار بالاست و امروزه زخم‌های مزمن یا زخم‌هایی که از توانایی ترمیم پائینی برخوردارند، از مشکلات مهم بالینی به شمار می‌روند. با توجه به این که آنزیم‌های iNOS و COX-2 القاپذیر هستند و از دسته عوامل مهم در التهاب، ایمنی‌زایی، تکثیر سلولی، تعمیر، آنژیوژنز، تمایز سلولی و آپوپتوز می‌باشند سنجش این آنزیم‌ها را انتخاب نموده‌ایم. در این تحقیق سعی می‌شود با تحریک این فاکتور‌ها توسط لیپو پلی ساکارید باکتری‌های گرم منفی در سلول‌های پوست، میزان تغییر فاکتور‌های التهابی و همچنین اثر احتمالی آنها در التیام زخم را مورد بررسی قرار دهیم.
۱-۳٫ اهداف پژوهش
تعیین میزان فعالیت COX-2 و NO و H₂O₂ در پوست سالم موش
تعیین میزان تغییر فعالیت آنزیم COX-2 پس از اثر دادن لیپوپلی ساکارید بر زخم پوست موش
تعیین میزان تغییر NO پس از اثر دادن لیپوپلی ساکارید بر زخم پوست موش
تعیین میزان تغییر H₂O₂ پس از اثر دادن لیپو پلی ساکارید بر زخم پوست موش
۱-۴٫ سئوالات و فرضیه‌ها:
با اثر دادن لیپوپلی ساکارید بر روی زخم پوست موش میزان فعالیت آنزیم COX-2 تغییر می‌کند.
با اثر دادن لیپوپلی ساکارید بر روی زخم پوست موش میزان فعالیت NO تغییر می‌کند.
با اثر دادن لیپوپلی ساکارید بر روی زخم پوست موش میزان فعالیت H₂O₂ تغییر می‌کند
تیمار لیپوپلی ساکارید بر روی زخم پوست بر تغییرات ترمیم و التیام زخم اثر دارد.
فصل دوم
مروری بر متون گذشته
۲-۱٫ لیپوپلی‌ساکارید
در سال ۱۹۹۱،Yoshihito Ishikawa و همکارانش التهاب پوستی و نکروز هموراژیک که به توسط لیپوپلی ساکارید و لیپید A باکتری‌ها ایجاد می‌شوند را در موش مورد مطالعه قرار دادند و به این نتیجه رسیدند که ادم حاصل از تزریق LPS در پاسخ به فعالیت کمپلمان ایجاد می‌شود در حالیکه واکنش‌های هموراژیک به فعالیت سلول‌های هدف مثل ماکروفاژ‌ها و سلول‌های اندوتلیال درون رگی مربوط می‌شوند.
در سال ۱۹۹۷، Umezava Kei و همکارانش با روش RT-PCR و روش ایمونوهیستوشیمی‌با آنتی‌بادی‌های اختصاصی iNOS افزایش میزان mRNA iNOS در بافت‌های آلوده شده با سالمونلا را گزارش کردند.
در سال ۱۹۹۷، Emiko Fujii و همکارانش نقش نیتریک اکساید، پروستاگلاندین و تیروزین کیناز را در فعالیت فاکتور رشد اندوتلیال رگ(VGEF) در پوست موش را مورد بررسی قرار دادند و به این نتیجه رسیدند که این عوامل در افزایش بیان VGEF و افزایش نفوذپذیری رگ‌ها و نشت پلاسما مؤثر هستند.
در سال ۲۰۰۰، Hiroysau Ishida و همکارانش طبق مطالعاتی که درباره‌ی تأثیر LPS و آنالوگ آن(OnO-4007) روی تغییر نفوذپذیری رگ‌ها در پوست موش انجام دادند به این نتیجه رسیدند که LPS می‌تواند ۶۰ دقیقه بعد از تزریق، میزان نشت پلاسما را بالا ببرد ولی آنالوگ آن فقط در دوز‌های بالاتر می‌تواند اثر مشابه را بگذارد که این به دلیل تاثیر میانجی‌ها و رسپتور‌های متفاوت بر روی آنهاست.
در سال ۲۰۰۰، Andres Vazquez-Torres و همکارانش با بررسی رابطه‌ی بین ماکروفاژ‌ها و سالمونلا در کشت بافت به این نتیجه رسیدند که iNOS القا می‌شود.
در سال ۲۰۰۴،Kei-ichi Uchiya و Toshiaka Nikai با بررسی جزیره‌ی بیماریزایی ۲ در سالمونلا به این نتیجه رسیدند که سالمونلا می‌تواند باعث فعال شدن ERK1/2 با واسطه‌ی SPI-2 شود و به دنبال القای تولید PGE2 و PGI2 در ماکروفاژ‌ها منجر به افزایش بیان COX-2 شود.
در سال ۲۰۰۰، Bobby J.Cherayil و همکارانش آنالیز القای بیان iNOS در ماکروفاژ‌ها توسط سالمونلا انجام دادند و به این نتیجه رسیدند که تیپ وحشی سالمونلا می‌تواند هم میزان پروتئین iNOS و هم میزان mRNA مربوطه را در سلول‌های ماکروفاژ موش افزایش دهد. میانجی نهایی القای iNOS، پروتئین افکتوری است که از طریق سیستم ترشحی تیپ III و در مسیری وابسته به SipB، SipC و SipD به داخل ماکروفاژ‌ها منتقل می‌شود.
در سال ۲۰۰۰، Emiko Fujii و همکارانش طی مطالعاتی که در مورد تزریق زیر جلدی و یا درون پوستی LPS در پوست موش و رت انجام دادند به این نتیجه رسیدند که افزایش نفوذپذیری رگها توسط LPS در موش‌های وحشی بطور عمده وابسته به تولید NO به وسیله‌ی iNOS می‌باشد ولی در موش‌های فاقد iNOS، LPS با مکانیسمی‌مستقل از iNOS میزان نفوذپذیری رگها را تغییر می‌دهد که این کار را به واسطه‌ی میانجی‌هایی مثل ایکوزانوئید‌ها، هیستامین و TNF-αانجام می‌دهد.
در سال ۲۰۰۱، Kaoru Irie و همکارانش طی مطالعه‌ای که روی اثر ضد التهابی عوامل افزایش دهنده‌ی CAMP در مدل موشی که نفوذپذیری درون رگی آن با لیپوپلی ساکارید تغییر یافته بود انجام دادند به این نتیجه رسیدند که عوامل افزایش دهنده‌ی CAMP با جلوگیری از بیان TNF-α به واسطه‌ی LPS، در کاهش میزان نفوذپذیری رگها اثر می‌گذارند. با تزریق زیر جلدی LPS به موش، پس از یک ساعت میزان TNF-α بالا می‌رود که در این زمان CAMP می‌تواند تولید آن را مهار کند و در کاهش نفوذپذیری رگ‌ها اثر بگذارد. ولی در مقابل، IL-1 که به واسطه‌ی LPS افزایش یافته است، تحت‌تاثیر هیچکدام از عوامل CAMP قرار نمی‌گیرد.