اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (۵/۰ مولار۸ =PH)
۷۲/۳ گرم
آب مقطر تا حجم کلی
ا لیتر
لودینگ بافر Loding buffer
بروموفنل آبی (Bromophenol blue)
۱۲۵/۰ گرم
گلیسرول
۲۵ میلی لیتر
اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (۸ =PH)
۲۰ میلی لیتر
پس از مخلوط کردن این مواد آنها را با آب مقطر به حجم ۵۰ میلی لیتر رسانده و سپس در لوله دردار ریخته و ۳۰ دقیقه در داخل بشر آب جوش قرار داده شد.[۳۲]
۳-۵-روش اجرا
۳-۵-۱- جمع آوری اطلاعات :
در زمان پذیرش بیماران مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله (عج ) تهران اطلاعاتی شامل جنسیت و سن و پاسخ تست آنتی بیوگرام از نظر ( حساس- نیمه حساس و یا مقاوم بودن هر یک از آنتی بیوتیک ها) تهییه شد. نمونه های مورد استفاده در این تحقیق از بیماران مبتلا به عفونت ادراری مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله (عج) تهران در طی تیر ماه تا دی ماه ۱۳۹۳، حدود ۷ ماه جمع آوری شده اند.
۳-۵-۲-انجام امور باکتریولوژیک
۳-۵-۳- نمونه برداری ،کشت ، جدا سازی و تعیین هویت باکتری ها
۳-۵-۳-۱ نمونه برداری
طبق روش استاندارد نمونه بالینی از جمله ادرار بیمار مشکوک به عفونت ادراری، از اواسط ادرار بیمار در ظروف استریل یکبار مصرف جمع آوری شد و پس از آنالیز ادرار و مشاهدات میکروسکوبی و رویت WBC1 بیش از اندازه که نشانگر عفونت در ادرار می باشد، بلافاصله نمونه های مثبت به محیط های کشت کروم آگار برده شد و سپس روی محیط کشت EMB agar ۲ کشت داده شدند و پس از گذراندن ۲۴ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد پس از مشاهده کلونی هایی با جلای سبز متالیک و براق باکتری اشرشیا کلی تعیین هویت می گردد و سپس از کلونی های تک باکتری موجود در محیط کشت EMB به محیط کشت مایع L.B Broth3 تلقیح داده شد و سپس به مدت ۱۸-۱۶ ساعت در انکوباتور شیکر دار با دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به منظور هوادهی بهترانتقال داده شد.
۳-۵-۳-۲- طرز تهیه محیط های کشت
محیط کشت ائوزین متیلن بلو (EMB)
این محیط کشت، محیط افتراقی مفیدی در جداسازی و شناسایی باکتری های روده ای گرم منفی است رنگ های ائوزین Y متیلن بلو، اجزاء انتخابی هستند که افزوده شده اند، تا در حالی که به باکتری های گرم منفی اجازه رشد می دهند، از رشد باکتری های گرم مثبت جلوگیری کنند.[۳۳]
کربوهیدرات های لاکتوز و ساکارز افزوده شده اند تا ایزوله ها را بر اساس تخمیر لاکتوز تفکیک کنند، تخمیر با تغییر رنگ و رسوب رنگ های افزوده شده، در اثر افت PH ۱، مشخص و ارزیابی می شود. ساکارز به عنوان منبع کربوهیدرات دیگری برای تخمیر کنندگان کند لاکتوز عمل می کند و باعث می شود که به عنوان پاتوژن های ممکن در نظر گرفته نشوند و به موقع حذف گردند. اشرشیا کلی، یک کلی فرم تخمیر کننده لاکتوز است که به طور شاخص و تیپیک، کلونی های آبی-سیاه با درخشندگی فلزی متمایل به سبز ایجاد می کند. دیگر کلی فرم های تخمیر کننده مثل انتروباکتر، کلنی های صورتی تشکیل می دهند. کلونی های غیر تخمیر کننده، شفاف بوده، کهربایی رنگ یا بی رنگ هستند برای ساخت این محیط کشت ما از پودر EMB agar (شرکت مرک آلمان) طبق دستور العمل شرکت سازنده (۳۶ گرم در یک لیتر)، مقدار ۶/۳ گرم از پودر را در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر که قبلاً درون ارلن مایر اضافه کردیم. آنرا کاملاً حل نموده و سپس با پنبه درب ارلن مایر را مسدود کرده و آن را روی سه پایه چراغ گازی حرارت داده، تا زمان جوشیدن آن را چند بار تکان داده تا خوب حل شودو به مدت ۱ دقیقه در ماکروفر بجوشد و پس از آنکه مایه به جوش آمد، آن را برداشته و با تکه کاغذ آلمینیومی روی پنبه را پوشانده و ظرف را درون اتوکلاو گذاشته تا در فشار ۱۵ پوند بر اینچ مربع (PSI)2 و حرارت ۱۲۱ درجه سانتی گراد (۲۵۰ فارنهایت) به مدت ۱۵ دقیقه استریل شود. بعد از استریل کردن پس از چند ثانیه تا کمی خنک شود پلیت های استریل را آماده کرده و EMB را به درون پلیت ها ریخته و کمی صبر می کنیم تا مایع سرد شود لازم به ذکر است که پلیت ها باید در شرایط استریل و تمامی مراحل کار باید در کنار شعله باشد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
محیط کشت لوریل سولفات براث (Lauryl sulfate broth)
جهت تهیه این محیط کشت ما از پودرL.B broth (Miller) (شرکت مرک آلمان) طبق دستور العمل شرکت سازنده (۲۵ گرم در یک لیتر)، مقدار ۵/۲ گرم در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر که قبلاً درون ارلن مایر اضافه کردیم. آنرا کاملاً حل نموده و سپس به لوله های آزمایش انتقال داده سر هر لوله را با پنبه مسدود کرده و تمامی لوله ها را در یک ظرف بزرگ قرار داده و سر ظرف را با کاغذ آلمینیوم کاملاً پوشانده و ظرف را درون اتوکلاو گذاشته تا در فشار ۱۵ پوند بر اینچ مربع (PSI) و حرارت ۱۲۱ درجه سانتی گراد (۲۵۰ فارنهایت) به مدت ۱۵ دقیقه استریل شود.[۳۴]
پس از خنک شدن کلونی های تک باکتری را از محیط کشت EMB به لوله ها ی حاوی L.B broth تلقیح کرده، کشت ارگانیسم های خالص در ۵۰-۱۰ میلی لیتر از محیط های فوق انجام می گرفت و به مدت ۱۸-۱۶ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد در انکوباتور شیکر دار انکوبه می گردید. کدورت لوله های واجد کشت در طول موج ۶۰۰ نانومتر قرائت می شد. در صورتی که OD1 قرائت شده مناسب بود برای استخراج ژنوم مورد استفاده قرار می گرفت.
۳-۵-۳-۳-نگهداری نمونه های عفونت ادراری
نگداری و انبارش نمونه ها طبق روش استاندارد انجام شد. نمونه ها را که در محیط کشت آگار هستند را تا انجام آزمون درون پلیت های استریل و به دور پلیت ها پارافیلم پیچیده تا از خشک شدن نمونه جلوگیری به عمل بیاید و سپس در طی مراحل آزمون درون یخچال ۴- درجه سانتی گراد نگه داری می شود و سپس طبق روش های استاندارد و رعایت شرایط استریل در زیر هود و یا کنار شعله به کمک لوپ استریل از نمونه ها کشت سه منطقه ای بر روی محیط EMB agar داده می شود و پس از کشت نمونه ها به مدت ۲۴ ساعت درون انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد نگه داری می شوند و پس از یک شبانه روز در صورت مشاهده کلونی های سبز متالیک و براق به مفهوم شناسایی و اثبات باکتری اشرشیا کلی می باشد. از کلونی های تک اشرشیا کلی به محیط کشت LB.Broth باکتری تلقیح می شود و پس از ۲۴ ساعت در انکوباتور شیکر دار که به منظور هوادهی بهتر استفاده می گردد قرار می دهیم.
۳-۵-۳-۴-نگهداری سویه باکتری
به منظور نگه داری سویه های اشرشیا کلی تا زمان نهایی انجام تحقیق و تهییه استوک کلیه ایزوله ها ی مثبت در محیط کشت SKIM Milk با غلظت ۲۰% و واجد ۱۵-۲۰% گلیسرول در فریزر ۲۰- درجه سانتی گراد نگه داری شدند.[۳۵]
۳-۵-۴– استخراج، تعیین کمیت و کیفیت DNA به (روش NANO DROP):
۳-۵-۴-۱- استخراج DNA :
برای استخراج DNA در این پایان نامه از روش Boiling استفاده گردید. جهت استخراج DNA جدایه های ذخیره شده، ابتدا بن ماری ۳۷ درجه سانتی گراد را روشن کرده و حجم مناسبی از آب را داخل بن ماری یا حمام آب گرم ریخته تا آب بجوش بیاید و به دمای ۱۰۰ درجه سانتی گراد برسد در همین حین با بهره گرفتن از سر سمپلر ها و تیوپ هایی که قبلاً در فور ۳۷ درجه استریل شده بودن از محیط کشت مایع L.B Broth هم حجم تیوپ های ۲/۰ ریخته و سپس با حفظ بالانس در دستگاه سانتریوفیوژ با دور ۵۰۰۰RPM ۱ به مدت ۷ دقیقه سانتریفیوژ کرده و پس از آن مایع رویی که حاوی باکتری هست را دور ریخته و به رسوب حاصل ۲۵۰λ آب مقطر آمپولی اضافه می کنیم و سپس با سر سمپلر آبی خوب پیپتاژ و مخلوط می کنیم. درب تیوپ ها را بسته و دورش را با پارافیلم کاملاً عایق بندی می کنیم تا آب به داخل تیوپ نفوذ نکند و حال داخل یک یونولیت جاگذاری کرده تا روی آب شناور باشد و سپس داخل بن ماری که از قبل آماده کرده بودیم به مدت ۵ دقیقه قرار می دهیم و سپس سانتریفیوژ با دور ۱۰۰۰۰ به مدت ۱۰ دقیقه حال مایع رویی ما DNA می باشد و سپس هم حجم DNA ایزوپروپانول سرد اضافه می کنیم و سپس نگه داری در فریزر ۲۰- به مدت یک ساعت و پس از آن سانتریفیوژ توسط سانتریفیوژ یخچال دار با دمای۴- درجه سانتی گراد با دور ۱۵۰۰۰RPM به مدت ۲۰ دقیقه. سپس مایع رویی را دور ریخته به رسوب خشک (ژله مانند) ۵۰λ آب مقطر آمپولی اضافه شود و سپس تیوپ ها به مدت ۵/۰ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد گذاشته شد تا DNΑ کاملاً حل شود.
۳-۵-۴-۲– کمیت سنجی و غلظت سنجی DNA استخراج شده :
معمولترین روش جهت تعیین غلظت DNA، استفاده از اسپکتروفتومتر است. بازهای نیتروژنی موجود در نوکلئوتیدهای یک رشته اسید نوکلئیک، نور فرابنفش (UV) را در طول موج ۲۶۰ نانومتر میباشند. با بهره گرفتن از سل کوارتز یک سانتی متری، ۵۰ میکروگرم بر میلی لیتر DNA دو زنجیرهای در طول موج ۲۶۰ نانومتر جذبی برابر یک خواهد داشت. وجود اسید آمینهی تریپتوفان در پروتئین باعث جذب در ۲۸۰ نانومتر میشود. نسبت جذب ۲۶۰ به ۲۸۰، خلوص DNA را نشان میدهد. این نسبت باید بین ۸/۱ تا ۲ باشد. اگر نسبت کوچکتر از ۸/۱ باشد، آلودگی DNA را با پروتئین یا فنل نشان میدهد و نسبت بزرگتراز ۲ به دلیل وجود RNA در نمونه می باشد.[۳۶]
از تقسیم جذب نوری (OD) در طول موج ۲۶۰ نانومتر به جذب نوری در طول موج ۲۸۰ نانومتر میزان خلوص نمونه ی DNA بدست آمد به این صورت که با از دستگاه NANO DROP که متصل به کامپیوتر می باشد ابتدا مقدار کمی در حد یک حباب آب مقطر ریخته و سپس Blank را زده تا دستگاه آماده اندازه گیری شود و سپس مقدار ۱λ از ژنوم را در جایگاه مورد نظر ریخته و سپس با زدن کلید Measure عمل محاسبه انجام می گیرد و تصویری همراه با نمودار از ژنوم روی صفحه کامپیوتر حاصل می شود (تصویر شماره۳-۱).
تصویر شماره ۳-۱ : کمیت سنجی و غلظت سنجی DNA استخراج شده با بهره گرفتن از دستگاه NANO DROP
۳-۵-۵- انجام آزمایشات مولکولی:
۳-۵-۵-۱- پرایمر ها:
برای این منظور ابتدا توالی ژن های مورد نظر از پایگاه داده ها NCBI استخراج و سپس یک جفت پرایمر اختصاصی برای هر ژن با بهره گرفتن از نرم افزار آنلاین Primer3 با آدرس سایتی (http://frodo.wi.mit.edu/primer3) طراحی گردید. در ادامه میزان اختصاصی بودن پرایمرها با بهره گرفتن از Primer-blast با آدرس اینترنتی (http://www.ncbi.gov/tools/primer-blast )مورد ارزیابی قرار گرفت و به منظور آنالیز جهت اطمینان از ساختارهای ثانویه از نرم افزار oligo analyzer استفاده شد. طبق بررسی های به عمل آمده و مرور مطالعات توسط محققین جفت پرایمرهای مناسب انتخاب و جهت تهیه به شرکت پیشگام سفارش داده شد. پرایمرها مهمترین عامل در موفقیت یا عدم موفقیت واکنشPCR هستند و معمولاً براساس توالی شناخته شده DNA الگو طراحی می شوند. اگر پرایمرها به طور صحیح طراحی شده باشند واکنش PCR منجر به تکثیر قطعه ای از DNA می شود که با ناحیه هدف مولکول الگو مطابقت دارد و در صورتی که پرایمرها به طور صحیح طراحی نشوند واکنش با شکست روبه رو می شود. در این حالت هیچ قطعه ای تکثیر نخواهد شد و یا اینکه قطعات اشتباهی تکثیر خواهند شد(جدول ۳-۱).
